[文獻分享]流式多色分析——子宮內(nèi)白細胞的分離與鑒定

在懷孕期間，母胎界面（maternal-fetal interface）是一個活躍的免疫部位。胎兒和母體組織之間的這種親密接觸為胎兒提供了充足暴露于母體免疫系統(tǒng)的抗原。母體免疫細胞在維持子宮內(nèi)平衡中發(fā)揮重要作用，在著床和胎盤早期促進促炎狀態(tài)，在妊娠中期和晚期促進抗炎環(huán)境，最終在分娩期間促炎環(huán)境形成。母體免疫細胞和胎兒滋養(yǎng)層細胞是母胎界面炎癥和免疫調(diào)節(jié)反應(yīng)的重要調(diào)節(jié)因子，有益于子宮內(nèi)的免疫環(huán)境。

Kahn等人采用了一種從胎盤床收集白細胞的技術(shù)，即在剖腹產(chǎn)后使用手術(shù)海綿擦拭子宮腔。這種方法通常用于確保胎盤從子宮腔中完全移除并清除多余血液，因此不會給患者帶來額外的風(fēng)險。本文采用這種方法分析胎盤床NK細胞、T細胞、B細胞和單核細胞的表型，并與外周血樣本中對應(yīng)細胞進行比較。

流式分析使用的抗體，如下表所示（BD LSRII flow cytometer）：

圖1  在人類足月剖腹產(chǎn)分娩時，PBMC和UBMC（uterine blood mononuclear cells，子宮血單個核細胞）樣本的白細胞分析。

（A）從PBMC和UBMC樣本中識別主要白細胞亞群的圈門策略。

（B）活細胞和活CD45⁺細胞：

（i）單核細胞：CD45⁺CD14⁺；

（ii）CD4 T細胞：CD45⁺CD3⁺CD4⁺CD8^-；

CD8 T細胞：CD45⁺CD3⁺CD4^-CD8⁺； 

（iii）CD127^high T細胞 ：CD45⁺CD4⁺CD25⁺⁺CD127^highFoxP3^- 和

T regulatory細胞：CD45⁺CD3⁺CD4⁺CD8^-CD25⁺FoxP3⁺CD127^low

（iv）NK細胞亞群：CD3^-CD16⁺CD56⁺和CD3^-CD16^-CD56⁺⁺ 

（v）B細胞：CD3^-CD19⁺和活化的B細胞：CD3^-CD19⁺CD86⁺HLA-DR⁺。

子宮NK細胞具有CD45⁺CD3^-CD16^-CD56⁺⁺的特征性表型，外周血樣本中也具有少量相同表型的細胞。同樣，傳統(tǒng)NK細胞的表型為CD3^-CD16⁺CD56⁺⁺，這些細胞占外周NK細胞的大部分。而胎盤床細胞中CD16^-CD56⁺⁺ NK細胞比外周血樣本更豐富（CD45⁺CD3^-百分比分別為18.41 ± 3.44% vs. 2.73 ± 0.29%，N = 10）（見下圖2）。

圖2 在足月剖腹產(chǎn)分娩時，CD16^-CD56⁺⁺和CD16⁺CD56⁺⁺ NK細胞亞群的檢測。

為了比較CD16^-CD56⁺⁺和CD16⁺CD56⁺⁺細胞在胎盤床和外周血中的活化狀態(tài)，本文檢測了細胞表面脫顆粒標(biāo)志物CD107a的表達。胎盤床血中活化CD16^-CD56⁺⁺細胞的百分比與外周血相當(dāng)（分別為35.87 ± 5.84%和47.84 ± 5.91%）（圖3A）。同樣，胎盤床血中活化CD16⁺CD56⁺細胞的百分比與外周血相似（分別為52.86 ± 4.74%和52.76 ± 5.29%）（圖3B）。

圖3 在足月剖腹產(chǎn)分娩時，活化（CD107a⁺） CD16^-CD56⁺⁺和活化CD16⁺CD56⁺⁺細胞亞群的檢測。

與外周血白細胞相比，胎盤床樣品中的CD16^-CD56⁺⁺NK細胞明顯表達更高的CCL5 mRNA（圖4）。另一方面，胎盤床和外周血中CD16⁺CD56⁺⁺細胞表達的RANTES mRNA水平相似。此外，在胎盤床和外周血樣本中，兩種NK細胞中IL8和PGF mRNA水平均無差異。

圖4 PrimeFlow RNA檢測：CCL5、IL8和PGF。

   外周血單核細胞（CD45⁺CD14⁺）占比為12.47% ~ 44.69% （N=10），平均百分比為27.42 ± 3.31%。胎盤床樣本中CD45⁺CD14⁺單核細胞的平均百分比（占活CD45⁺細胞的6.38 ± 1.45%）低于PBMC（27.42 ± 3.31，圖5A）。此外，與外周血單核細胞相比，胎盤床單核細胞活化標(biāo)志物CD86和HLA-DR的表達比例較低（在CD14⁺細胞占比分別為50.24 ± 7.53%和90.63 ± 2.60%）（圖5B）。

圖5 總的白細胞（活CD45⁺細胞）中CD14⁺單核細胞的百分比。

外周血B細胞（CD45⁺CD3^-CD19⁺）占總活的CD45⁺白細胞比例高于胎盤床樣品（分別為10.34 ± 0.94%和5.36 ± 1.33%）（圖6A）。為了研究B細胞的活化狀態(tài)，本文還檢測了CD86和人類白細胞抗原（HLA）II類分子HLA-DR的表達。外周血和胎盤床樣品中表達這兩種受體的B細胞比例相似（圖6B）。

圖6 與外周血白細胞相比，足月子宮白細胞含有的B細胞比例較低。

   胎盤床和外周血中活的CD45⁺白細胞中CD4⁺ T淋巴細胞的平均百分比相似（圖7A）。然而，與外周血樣本相比，胎盤床中CD8⁺ T細胞的占比更高（圖7B）。

圖7 PBMC和UBMC白細胞群中T細胞群的檢測。

本文展示了一種使用外科紗布成功分離活的蛻膜細胞的方法，并通過流式細胞術(shù)分析免疫細胞的特性。根據(jù)該方法獲得的子宮白細胞存活率>95%，除流式細胞術(shù)分析外，還可以用于細胞分選和功能分析。借助免疫細胞亞型特異性標(biāo)記物，以流式細胞術(shù)的方法進行分離，可以提高靶細胞群的純度。結(jié)果表明，這種方法可用于子宮白細胞的研究，包括妊娠并發(fā)癥等情況。

參考文獻：Parasar P, Bernard M, Ahn SH, et al. Isolation and characterization of uterine leukocytes collected using a uterine swab technique. Am J Reprod Immunol. 2022;88（5）:e13614. doi:10.1111/aji.13614.