【文獻分享】一種可“DIY”的四聚體——Flex-TTM在腫瘤新抗原研究中的應用

前言

T細胞介導的免疫應答是由抗原遞呈細胞和T細胞之間通過主要組織相容性復合物（MHC）和T細胞受體（TCR）的相互作用決定的，因此鑒定和分析抗原特異性T細胞在疫苗療效監(jiān)控，癌癥研究、病毒感染、抗原分析等研究種至關重要。四聚體技術可在單細胞水平上標記抗原特異性T細胞并通過流式細胞術檢測。四聚體通常由4個MHC單體分子和1個鏈霉親和素組成，是一種快速、方便的抗原特異性T細胞檢測技術。 

下面我們跟大家分享一篇運用Flex-T^TM “DIY”的四聚體（Flexible-Tetramers）進行腫瘤治療相關研究的文獻，作者使用Flex-T^TM UV-labile Momomer UVX（Biolegend，Cat#280004）制備針對Neo-T特異性抗原的四聚體進行抗原特異性T細胞檢測分析。

研究背景

過繼性T細胞療法（ACT）正成為癌癥患者強有力的治療選擇，包括嵌合抗原受體（CAR） T細胞、T細胞受體（TCR）T細胞和腫瘤浸潤淋巴細胞（TILs）的過繼轉(zhuǎn)移。其中，有研究證實了TILs的過繼轉(zhuǎn)移可以介導幾種實體瘤的持久消退，然而，然而，收集TILs需要對腫瘤組織進行侵入性采樣，并且往往受到切除腫瘤組織相對較小的限制，并且一些腫瘤部位也不容易接近。最近，一些研究報道在癌癥患者的外周血中發(fā)現(xiàn)了識別新抗原的T細胞克隆。外周血淋巴細胞（PBLs）中的T細胞能識別與TILs相同的P53新抗原。因此，PBL可能是開發(fā)新抗原靶向ACT治療癌癥患者的可靠且無創(chuàng)的T細胞來源。

通常在ACT之前需要進行非清髓性淋巴細胞耗竭（氟達拉濱和環(huán)磷酰胺是淋巴細胞耗竭化療中最常用的藥物），目的是抑制宿主免疫系統(tǒng)，以降低免疫原性，增加IL-2、IL-7、IL-15等的可用性，減少調(diào)節(jié)性T細胞，增加輸注T細胞的持久性。然而，淋巴細胞減少也會導致神經(jīng)毒性、中性粒細胞減少癥、貧血和更大的感染風險。淋巴細胞耗竭的劑量強度在不同的中心和臨床試驗中差異很大，并且似乎是T細胞產(chǎn)物特異性的。那么，四聚體檢測技術在本研究中扮演著何種角色呢？

研究內(nèi)容

針對這些問題，中山大學徐瑞華團隊在2023年6月10日發(fā)表了題為“A pilot study of lymphodepletion intensity for peripheral blood mononuclear cell-derived neoantigen-specific CD8⁺ T cell therapy in patients with advanced solid tumors”的研究論文。該研究開發(fā)了一種從癌癥患者的外周血單個核細胞（PBMCs）中產(chǎn)生個性化Neo-T（新抗原特異性CD8⁺ T細胞）的方法。作者建立了一個流程，包括通過生物信息學分析預測新抗原，并在25天內(nèi)大規(guī)模擴增新抗原特異性T細胞。為了評估Neo-T治療的臨床療效并確定Neo-T治療的最佳淋巴細胞耗竭強度，作者進行了一項首次在人體中使用氟達拉濱和環(huán)磷酰胺增加劑量的Neo-T治療的研究。該研究是一項開放標簽I期臨床試驗（NCT02959905），包括標準治療難治的局部晚期或轉(zhuǎn)移性實體瘤患者。

圖. 新抗原預測和Neo-T制造流程示意圖

圖. Neo-T療法臨床試驗圖

A：臨床試驗流程圖；B：臨床試驗方案

此外，為了確認每個患者產(chǎn)生的Neo-T能夠識別預測的新抗原，作者通過四聚體檢測技術檢測了Neo-T中的CD8⁺ T細胞以及新抗原特異性細胞。根據(jù)四聚體染色結(jié)果，所有Neo-T產(chǎn)物的細胞存活率和CD8⁺ T細胞百分比均大于90%，Neo-T中新抗原特異性T細胞在0.5%至45%之間。四聚體檢測大致流程如下：

四聚體檢測Neo-T細胞實驗流程

1、收集細胞，洗滌，在FACS緩沖液中重懸；

2、通過紫外線輻射介導的肽交換法生成肽- MHC單體，再與熒光標記的鏈霉親和素合成四聚體；

3、使用小鼠抗人CD3、CD8和Flex-T? 四聚體，在4°C下染色15分鐘；

4、在FACS緩沖液中洗滌兩次；

5、使用流式細胞儀對細胞進行分析，基于DAPI對活細胞圈門，并對“CD8⁺ pMHC -四聚體⁺細胞”進行分類；

6、使用流式數(shù)據(jù)處理軟件對數(shù)據(jù)進行分析。

（Flex-T^TM四聚體制備和流式染色詳細Protocol可前往Biolegend官網(wǎng)查詢：https://www.biolegend.com/en-us/protocols/flex-t-tetramer-preparation-and-flow-cytometry-staining-protocol）

圖：Neo-Ts細胞流式分析圈門策略

研究結(jié)果

研究結(jié)果表明，在Neo-T治療期間，從無淋巴細胞耗竭到高劑量治療，不同的淋巴細胞耗竭劑量耐受性良好。Neo-T療法在晚期實體瘤患者中顯示出良好的臨床療效，ORR（客觀緩解率）為33.3%（3/9），DCR（疾病控制率）為66.7%（6/9）。與高強度組相比，無淋巴細胞耗竭組在Neo-T治療期間出現(xiàn)PR（部分緩解）的患者更多。在兩名有反應的患者中檢查新抗原特異性TCR，并在淋巴細胞耗竭治療后顯示延遲擴張。

綜上，該研究揭示，沒有淋巴細胞耗竭的Neo-T療法可能是晚期實體瘤的安全且有前途的治療策略。

Flex-T^TM UV-labile Momomer——抗原特異性T細胞分析的理想工具

Flex-T^TM UV-labile Momomer，一款Biolegend推出的抗原特異性T細胞檢測工具，是一種預載了UV敏感多肽的生物素化MHC單體。在經(jīng)過UV照射后，Flex-T^TM UV-labile Momomer的多肽結(jié)合位點暴露，感興趣的目標肽加載，產(chǎn)生具有足夠親和力的“DIY” MHC Monomer，肽交換效率可使用ELISA進行檢測，“DIY” MHC Monomer與Streptavidin 組裝成不同的Tetramer。這種靈活的處理方式實現(xiàn)了感興趣多肽或者抗原特異性T細胞的高通量篩選。如今，這一款抗原特異性T細胞分析工具已被運用在多個研究方向中，例如腫瘤、感染性疾?。?/span>COVID-19、HBV等）、疫苗研發(fā)等。

本研究中使用的Flex-T?產(chǎn)品

參考文獻：

Li, D., Chen, C., Li, J., Yue, J., Ding, Y., Wang, H., Liang, Z., Zhang, L., Qiu, S., Liu, G., Gao, Y., Huang, Y., Li, D., Zhang, R., Liu, W., Wen, X., Li, B., Zhang, X., Zhang, X., & Xu, R. H. (2023). A pilot study of lymphodepletion intensity for peripheral blood mononuclear cell-derived neoantigen-specific CD8?+?T cell therapy in patients with advanced solid tumors. Nature communications, 14(1), 3447. https://doi.org/10.1038/s41467-023-39225-7

Supplementary Information：

https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/instance/10257664/bin/41467_2023_39225_MOESM1_ESM.pdf