脈沖場(chǎng)凝膠電泳技術(shù)

PFGE技術(shù)簡(jiǎn)介：

       1984年Schwartz和Cantor發(fā)明了交變PFGE技術(shù)， 解決了大片段DNA （＞40 kb） 差異的問(wèn)題， 同時(shí)提高了DNA的分辨力。此后,隨著PFGE技術(shù)的不斷改進(jìn),現(xiàn)已具有分辨出高達(dá)10Mb級(jí)DNA的能力。這一獨(dú)具的高分辨力使PFGE的應(yīng)用范圍已涉及到幾乎所有生物基因組結(jié)構(gòu)的研究。

工作原理： 大小不同的DNA 分子在交替變換方向的電場(chǎng)中做出反應(yīng)所需的時(shí)間不同， 一般較小的分子重新定向較快，在凝膠中移動(dòng)快；大的DNA分子比小的DNA分子定向慢， 在凝膠中移動(dòng)比較慢；根據(jù)各DNA分子遷移距離的不同從而可以達(dá)到分離不同大小的DNA 分子的目的。在所有分子分型方法中，脈沖場(chǎng)凝膠電泳以重復(fù)性好、分辨性強(qiáng)，被作為細(xì)菌分子分型的PFGE分型技術(shù)因其重復(fù)性好、分辯力強(qiáng)被譽(yù)為細(xì)菌分子分型技術(shù)的“金標(biāo)準(zhǔn)”,并推薦作為金黃色葡萄球菌等病原微生物分型的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)。

PFGE 瓊脂糖的選擇

       PFGE是以瓊脂糖作為支持介質(zhì)的電泳方法。不同支持物的PFGE其用途及作用效果不盡相同，依據(jù)不同的支持物可以將PFGE分為2種。

1．SeaKem Gold瓊脂糖PFGE

          SeaKem Gold瓊脂糖是一種高凝膠強(qiáng)度， 低電內(nèi)滲 （Electric endosmosis， EEO）， 標(biāo)準(zhǔn)膠凝溫度的瓊脂糖。此凝膠適于PFGE快速分辨50 kb～10 Mb的DNA和常規(guī)電泳方法分辨1～50 kb的DNA與PCR產(chǎn)物。因其高凝膠強(qiáng)度，使這種瓊脂糖在濃度很低（0.5%）時(shí)容易操作；因其低EEO特性，SeaKem Gold瓊脂糖中的DNA電泳遷移速度要顯著高于常規(guī)瓊脂糖凝膠，從而允許在常規(guī)電泳中分離更大的DNA片段并減少PFGE中DNA分離的耗時(shí)。因此，這種方法比較常用。 Lonza SeaKem? Gold Agarose（Cat# 50152，50150）

2．InCert瓊脂糖PFGE 

          兆堿基片段DNA制備獲準(zhǔn)使用的瓊脂糖，是一種極為有用的制備PFGE用染色體DNA樣品的低熔點(diǎn)瓊脂糖。研究證實(shí)InCert瓊脂糖凝膠可支持凝膠中染色體DNA的制備和限制性核酸內(nèi)切酶反應(yīng)。吳利先和黃文祥 參照Murray等的方法利用InCert瓊脂糖進(jìn)行PFGE鑒定，并獲得sprE基因突變株。Lonza InCert? Agarose（cat# 50121, 50123）。

PFGE的應(yīng)用范圍：

1. 微生物分子分型；

2. 細(xì)胞凋亡的檢測(cè)；

3. 臨床診斷和治療；

4. 耐藥菌株流行趨勢(shì)分析；

5. 抗生素敏感株和多重耐藥菌株的分子分型。

操作步驟：PFGE的簡(jiǎn)要操作步驟包括樣品的包埋、原位裂解、稀少酶切位點(diǎn)的限制性內(nèi)切酶對(duì)染色體DNA的消化、脈沖場(chǎng)電泳、凝膠的EB染色觀察5個(gè)步驟。

參考文獻(xiàn)：

1. 王麗麗, 徐建國(guó).脈沖場(chǎng)凝膠電泳技術(shù)（PFGE）在分子分型中的應(yīng)用現(xiàn)狀.疾病監(jiān)測(cè),2006.

2. 劉凱，袁雪姣.腸致病性大腸桿菌分離株的脈沖場(chǎng)凝膠電泳分析.現(xiàn)代預(yù)防醫(yī),2015.

3. 董棟,商軍.脈沖場(chǎng)凝膠電泳技術(shù)的應(yīng)用及其發(fā)展趨勢(shì).上海畜牧獸醫(yī)通,2014.

4. 劉志國(guó).崔步云.布魯菌分子分型方法應(yīng)用研究進(jìn)展.中國(guó)人獸共患病學(xué),2015.