IHC實驗步驟

標(biāo)本：組織標(biāo)本：石蠟切片（病理切片和組織芯片）、冰凍切片；細(xì)胞標(biāo)本：組織印片、細(xì)胞爬片、細(xì)胞涂片

操作步驟：

①石蠟切片制作

1、固定：取組織，用PBS沖洗，放入4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液內(nèi)固定12h

2、脫水：倒去固定液，用蒸餾水沖洗3次，再用50%酒精沖洗2次，用酒精逐級脫水，70%酒精1天，80%酒精過夜，95%酒精3h，無水酒精（Ⅰ）、（Ⅱ）各2h

3、透明：1:1無水酒精二甲苯45min，二甲苯（Ⅰ）、（Ⅱ）各30min

4、包埋：（恒溫箱內(nèi)進(jìn)行）浸入石蠟，1:1二甲苯石蠟（58℃）45min，石蠟（Ⅰ）、（Ⅱ）、（Ⅲ）共2.5h，用石蠟（Ⅲ）包埋組織

5、切片：包埋后的組織塊經(jīng)修整后，用切片機切成5-7μm，的石蠟帶

6、貼片：將組織石蠟塊在50℃溫水中展片，然后用處理干凈的載玻片撈片，組織帶可黏在載玻片上

（洗片：1%HCl浸泡過夜、蒸餾水沖洗、95%酒精浸泡2h后擦干 → 涂膠：防脫劑多聚賴氨酸）

7、烤片：68℃恒溫箱內(nèi)烤片2h

②SP三步法

1、脫蠟：脫蠟前應(yīng)將組織芯片在室溫中放置60min，或60℃恒溫箱中烘烤20min，后用二甲苯（Ⅰ）、（Ⅱ）浸泡，共25min

2、水化：無水酒精（Ⅰ）、（Ⅱ）各2min，下行至95%、80%、70%酒精（Ⅰ）（Ⅱ）各2min

3、PBS沖洗2-3次，每次5min

4、阻斷：3%H2O2去離子水（或80%甲醇）孵育10min，以滅活內(nèi)源性過氧化物酶活性

5、PBS沖洗2-3次，每次5min

6、抗原修復(fù)：置0.01M枸櫞酸緩沖液（PH 6.0）中用煮沸（95℃，15-20min），自然冷卻20min以上，再用冷水沖洗缸子，加快冷卻至室溫

7、PBS沖洗2-3次，每次5min

8、封閉：滴加正常山羊血清封閉液，室溫孵育20min，甩去多余液體

9、滴加Ⅰ抗50μl，室溫靜置1h，或者37℃1h，或者4℃過夜（需在37℃復(fù)溫45min）

10、PBS沖洗2-3次，每次5min

11、滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的Ⅱ抗40～50μl，室溫靜置1h，或37℃1h

12、PBS沖洗2-3次，每次5min

13、滴加SP（鏈霉親和素-過氧化物酶），室溫或37℃孵育30min-1h

14、PBS沖洗2-3次，每次5min

15、顯色：DAB顯色5-10min，在顯微鏡下掌握染色程度（胞漿呈棕色者判定為陽性細(xì)胞）

（顯色劑的配置：在1ml水中加1滴顯色劑A，搖勻，然后加1滴顯色劑B，搖勻，再加1滴顯色劑C，搖勻）

（A：DAB  B：H2O2 C：磷酸緩沖液）

16、自來水沖洗10分鐘終止反應(yīng)

17、復(fù)染：蘇木精復(fù)染2min，鹽酸酒精分化

18、自來水沖洗10-15min

19、常規(guī)脫水、透明、封片（用中性樹膠滴在組織旁邊，再用蓋玻片蓋上）、鏡檢

③結(jié)果分析：每張切片選擇5個高倍鏡視野（400X），應(yīng)用圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行定量灰度掃描后進(jìn)行分析。