拿什么拯救您的細(xì)胞穩(wěn)轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)？是時(shí)候展現(xiàn)真正的技術(shù)了

一般來說，外源基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞可分為瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染導(dǎo)入的DNA僅能在動(dòng)物細(xì)胞中維持?jǐn)?shù)天，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染導(dǎo)入的DNA能整合進(jìn)動(dòng)物細(xì)胞基因組中，隨后細(xì)胞經(jīng)過分裂增殖形成穩(wěn)定表達(dá)轉(zhuǎn)染基因的細(xì)胞系。在轉(zhuǎn)染的基因表達(dá)質(zhì)粒（或共轉(zhuǎn)質(zhì)粒）上添加選擇標(biāo)記，是篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞的最常用方法之一。

想要做好穩(wěn)轉(zhuǎn)，掌握下列幾項(xiàng)妥妥的沒問題~

選擇穩(wěn)轉(zhuǎn)質(zhì)粒

需要含有選擇標(biāo)記（例如抗生素抗性基因）的基因表達(dá)質(zhì)粒，選擇標(biāo)記可以位于基因表達(dá)質(zhì)粒上，或者位于共轉(zhuǎn)染的單獨(dú)的質(zhì)粒上。陰性對照應(yīng)使用不含選擇標(biāo)記的基因表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞。 

穩(wěn)轉(zhuǎn)之前 

• 確保使用的細(xì)胞系可以從分離的細(xì)胞中產(chǎn)生克隆，因?yàn)橐恍┘?xì)胞需要互相接觸才能生長；

• 選擇合適的篩選標(biāo)記；

• 選擇適合您細(xì)胞類型的轉(zhuǎn)染方法；

• 通過建立劑量-反應(yīng)曲線（殺傷曲線）確定細(xì)胞類型的篩選條件（Ausubel等，1995）。

殺傷曲線建立

最適濃度通過建立細(xì)胞殺傷曲線來確定。每種真核細(xì)胞系對不同抗生素的敏感度不同(某些細(xì)胞系能夠完全抵抗某種抗當(dāng)素)，針對每種用于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的新細(xì)胞系或細(xì)胞株，殺死未轉(zhuǎn)染細(xì)胞所需的最適濃度必須通過實(shí)驗(yàn)來確定。

(*應(yīng)為每種細(xì)胞類型建立殺傷曲線，并且每次使用新批次的選擇性抗生素)

遺傳霉素（Geneticin, G418）是一種氨基糖甙抗生素，是穩(wěn)定轉(zhuǎn)染常用的篩選抗生素之一。哺乳動(dòng)物細(xì)胞的篩選濃度根據(jù)細(xì)胞類型等多種因素而變化，以InvivoGen的G418為例（不同廠家不同批次產(chǎn)品溶解度各有差異，僅供參考）。在開始實(shí)驗(yàn)前，建議通過測試幾種濃度（100 μg/ ml至1 mg / ml）來確定殺死宿主細(xì)胞系所需的最佳抗生素濃度。

InvivoGen建議的工作濃度：G418通常以400 μg/ ml的濃度使用。當(dāng)然仍需要為您的細(xì)胞確定最佳濃度。下面列出了常見哺乳動(dòng)物細(xì)胞使用G418篩選的濃度（參見下表）。

好不容易get到了實(shí)驗(yàn)技巧，奈何無機(jī)會試手？

小達(dá)君在開學(xué)/開工之際為大家準(zhǔn)備了InvivoGen的篩選抗生素G418免費(fèi)試用裝

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試用裝規(guī)格：1ml G418溶液 (濃度：100mg/ml)

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活動(dòng)時(shí)間：即日起，發(fā)完即止（數(shù)量有限~）

InvivoGen G418產(chǎn)品特點(diǎn)

產(chǎn)品濃度：100 mg/ml （in HEPES buffer）

CAS number：108321-42-2

質(zhì)控：每批產(chǎn)品都經(jīng)過全面測試，以確保不存在批次差異

純度：≥90％（HPLC）

內(nèi)毒素水平：<0.5 EU / mg

細(xì)胞測試：在G418敏感和G418抗性哺乳動(dòng)物細(xì)胞系中驗(yàn)證產(chǎn)品效果

產(chǎn)品信息

InvivoGen 1977年成立于法國，是法國最早的生物科技公司。公司成立的初期階段主要提供細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)試劑，如抗支原體、細(xì)菌、真菌污染的抗生素以及基因篩選抗生素（Blasticidin, Puromycin, Hygromycin B, G418, Zeocin）。隨著天然免疫研究熱點(diǎn)的興起，InvivoGen于2000年開始致力于天然免疫相關(guān)產(chǎn)品的研發(fā)和生產(chǎn)，并成為全世界最優(yōu)質(zhì)、最專業(yè)的天然免疫相關(guān)產(chǎn)品生產(chǎn)商。InvivoGen為天然免疫研究提供一整套研究方案，包括不斷更新的模式識別受體（PRRs）激動(dòng)劑和拮抗劑，PRRs報(bào)告基因細(xì)胞以及天然免疫信號通路的誘導(dǎo)劑和抑制劑等。