在常規(guī)的ELISpot實(shí)驗中，每個實(shí)驗孔只能檢測一種細(xì)胞因子。借助FluoroSpot就可以實(shí)現(xiàn)在一個孔內(nèi)同時檢測兩種或兩種以上的細(xì)胞因子或抗體。FluoroSpot擁有ELISpot的靈敏度，并且能夠同時分析幾種分泌物。這種高度靈敏的細(xì)胞分析方法相對穩(wěn)定，易于操作。并且適合于單個檢測和大規(guī)模篩選實(shí)驗。熒光系統(tǒng)能同時檢測多種分析物，Mabtech以此為依據(jù)研發(fā)出了高品質(zhì)的雙色和三色熒光FluoroSpot試劑盒。

• 優(yōu)勢一：FluoroSpot具有靈敏度高，操作簡便，應(yīng)用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)。

• 優(yōu)勢二：FluoroSpot能夠生成更多的數(shù)據(jù)，節(jié)省時間。與免疫斑點(diǎn)相比，使用的細(xì)胞和抗原均較少。

FluoroSpot 原理

FluoroSpot能夠分析抗原特異性的多功能T細(xì)胞，例如，IFN-γ和IL-2的分析。三明治夾心結(jié)構(gòu)在熒光斑點(diǎn)中得以應(yīng)用，不同特異性的單克隆捕獲抗體混合物被包被于96孔板的PVDF膜上，生物素標(biāo)記的檢測抗體識別一種分泌物，tag標(biāo)記的檢測抗體識別其它的分泌物來實(shí)現(xiàn)雙色或三色細(xì)胞因子分泌細(xì)胞的檢測。檢測通過帶有特定熒光基團(tuán)的共軛試劑放大信號斑點(diǎn)，可用自動讀板器進(jìn)行分析。

△雙色FluoroSpot原理圖

△三色FluoroSpot分析 能夠更容易的區(qū)分T細(xì)胞中不同的細(xì)胞因子

三色 FluoroSpot分析總共可以顯示7個亞群：3個單染的細(xì)胞因子，3個雙染的細(xì)胞因子，1個三色的細(xì)胞群。圖像顯示的是一個三色FluoroSpot分析結(jié)果。用一組病毒肽（CEF）刺激人的外周血單個核細(xì)胞（PBMC），分別用FITC標(biāo)記IFN-γ、CY3標(biāo)記IL-2和CY5標(biāo)記TNF-α。Overylay展示的是三個指標(biāo)疊后得到的結(jié)果。

用途

FluoroSpot用途廣泛，并且同樣適用于單個檢測和大規(guī)模篩選。三明治夾心法結(jié)合熒光基團(tuán)標(biāo)記的檢測試劑能夠?qū)ν粋€孔中兩個或兩個以上的分析物進(jìn)行分析。

（一）T-cellFluoroSpot--抗原特異性T細(xì)胞檢測的理想方法

通過分泌單，雙和三色細(xì)胞因子分析劃分功能性T細(xì)胞亞群在許多不同的研究領(lǐng)域均引起極大的興趣。FluoroSpot可用于疫苗開發(fā)，主要用于檢測和分析疫苗特異性免疫應(yīng)答。在癌癥研究中，F(xiàn)luoroSpot可用于，例如監(jiān)測腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞或通過同時分析IFN-γ和顆粒酶B的分泌，以提供細(xì)胞毒性T細(xì)胞反應(yīng)更直接的評估。Mabtech公司提供了各種不同的熒光斑點(diǎn)試劑盒用于單，雙和三色分析物的T細(xì)胞的分析，其中IFN-γ可單獨(dú)分析或與幾個不同的分析物同時進(jìn)行分析。

△HumanIFN-γ/IL-2雙色FluoroSpot

圖為細(xì)胞受PPD（純化蛋白衍生物）刺激分泌IFN-γ和/或IL-2的雙色熒光斑點(diǎn)分析。結(jié)果顯示在166個分泌IFN-γ的T細(xì)胞中，有114個細(xì)胞也能分泌IL-2。FITC(IFN-γ)和Cy3(IL-2)的圖像疊加后的斑點(diǎn)代表該細(xì)胞同時分泌這兩種細(xì)胞因子。

（二）B-cellFluoroSpot--確定分泌抗原特異性抗體細(xì)胞的總數(shù)

FluoroSpot可實(shí)現(xiàn)分析同一個孔中不同免疫球蛋白或亞型的表達(dá)情況。其主要應(yīng)用的領(lǐng)域包括各種疾病和由免疫接種引起的B細(xì)胞免疫應(yīng)答反應(yīng)。例如，IgG、IgA和IgM的抗原特異性分泌物，可在接種疫苗前后進(jìn)行檢測。Mabtech公司提供雙色FluoroSpot試劑盒用于檢測人的IgG/IgA和IgG/IgM，以及三色FluoroSpot的試劑盒同時檢測 IgG/IgA/IgM。

（三）其他類型的細(xì)胞

FluoroSpot還能夠用于樹突狀細(xì)胞、單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的研究中，該檢測可以根據(jù)細(xì)胞因子不同的分布描繪不同的亞群。

注：數(shù)據(jù)分析FluoroSpot要使用配備有測定不同熒光基團(tuán)的特定濾光片的自動讀板機(jī)。

☆Mabtech公司研發(fā)了能夠用于人、小鼠和非人靈長類來源樣本的FluoroSpot試劑盒

具體產(chǎn)品如下：